Maye xromatoqrafiyası xammal, aralıq məhsullar, preparatlar və qablaşdırma materiallarında hər bir komponentin tərkibini və çirkləri yoxlamaq üçün əsas üsuldur, lakin bir çox maddələrin etibar etmək üçün standart üsulları yoxdur, ona görə də yeni metodların hazırlanması qaçılmazdır. Maye faza üsullarının işlənib hazırlanmasında xromatoqrafik sütun maye xromatoqrafiyanın əsasını təşkil edir, ona görə də uyğun xromatoqrafik sütunun necə seçiləcəyi çox vacibdir. Bu yazıda müəllif üç aspektdən maye xromatoqrafiya sütununu necə seçəcəyini izah edəcək: ümumi fikirlər, mülahizələr və tətbiq sahəsi.
A. Maye xromatoqrafiya sütunlarının seçilməsi üçün ümumi fikirlər
1. Analitin fiziki və kimyəvi xassələrini qiymətləndirin: kimyəvi quruluş, həll olma qabiliyyəti, sabitlik (məsələn, oksidləşmənin/azaldılmanın/hidrolizləşmənin asan olub-olmaması kimi), turşuluq və qələvilik və s., xüsusən də kimyəvi quruluş əsasdır xassələri müəyyən edən amil, məsələn, birləşmiş qrup güclü ultrabənövşəyi udma və güclü flüoresansa malikdir;
2. Təhlilin məqsədini müəyyənləşdirin: yüksək ayırma, yüksək sütun səmərəliliyi, qısa təhlil müddəti, yüksək həssaslıq, yüksək təzyiqə davamlılıq, uzun sütun ömrü, aşağı qiymət və s. tələb olunurmu;
- Uyğun xromatoqrafik sütunu seçin: xromatoqrafik doldurucunun tərkibini, fiziki və kimyəvi xüsusiyyətlərini, məsələn, hissəcik ölçüsü, məsamə ölçüsü, temperatura dözümlülük, pH tolerantlığı, analitin adsorbsiyasını və s.
- Maye xromatoqrafiya sütunlarının seçilməsi üçün mülahizələr
Bu fəsildə xromatoqrafiya sütununun özünün fiziki və kimyəvi xassələri nöqteyi-nəzərindən xromatoqrafiya sütununu seçərkən nəzərə alınmalı olan amillər müzakirə olunacaq. 2.1 Doldurma matrisi
2.1.1 Silisium gel matrisi Əksər maye xromatoqrafiya sütunlarının doldurucu matrisi silikageldir. Bu növ doldurucu yüksək təmizliyə, aşağı qiymətə, yüksək mexaniki gücə malikdir və qrupları dəyişdirmək asandır (fenil bağlanması, amin bağlanması, siyano bağlanması və s.), lakin dözdüyü pH dəyəri və temperatur diapazonu məhduddur: Əksər silika gel matris doldurucularının pH diapazonu 2 ilə 8 arasındadır, lakin xüsusi modifikasiya edilmiş silika gellə bağlanmış fazaların pH diapazonu 1,5 ilə 10 arasında ola bilər və aşağı pH-da sabit olan xüsusi modifikasiya edilmiş silika gellə bağlanmış fazalar da var. pH 1-dən 8-ə qədər sabit olan Agilent ZORBAX RRHD stabil bağ-C18 kimi; silisium gel matrisinin yuxarı temperatur həddi adətən 60 ℃-dir və bəzi xromatoqrafiya sütunları yüksək pH-da 40 ℃ temperatura dözə bilir.
2.1.2 Polimer matrisi Polimer doldurucular əsasən polistirol-divinilbenzol və ya polimetakrilatdır. Onların üstünlükləri geniş pH diapazonuna dözə bilmələridir - 1 ilə 14 aralığında istifadə edilə bilər və yüksək temperaturlara daha davamlıdırlar (80 ° C-dən yuxarıya çata bilər). Silisium əsaslı C18 doldurucuları ilə müqayisədə bu növ doldurucu daha güclü hidrofobikliyə malikdir və makroməsaməli polimer zülallar kimi nümunələri ayırmaqda çox effektivdir. Onun çatışmazlıqları silisium əsaslı dolduruculara nisbətən sütunun səmərəliliyinin aşağı olması və mexaniki gücün daha zəif olmasıdır. 2.2 Hissəcik forması
Müasir HPLC doldurucularının əksəriyyəti sferik hissəciklərdir, lakin bəzən onlar nizamsız hissəciklərdir. Sferik hissəciklər daha aşağı sütun təzyiqi, daha yüksək sütun səmərəliliyi, sabitlik və daha uzun ömür təmin edə bilər; yüksək özlülüklü mobil fazalardan (məsələn, fosfor turşusu) istifadə edərkən və ya nümunə məhlulu özlü olduqda, qeyri-müntəzəm hissəciklər daha böyük xüsusi səth sahəsinə malikdir, bu da iki fazanın tam fəaliyyəti üçün daha əlverişlidir və qiymət nisbətən aşağıdır. 2.3 Hissəcik ölçüsü
Hissəcik ölçüsü nə qədər kiçik olarsa, sütunun səmərəliliyi bir o qədər yüksəkdir və ayrılma bir o qədər yüksəkdir, lakin yüksək təzyiq müqaviməti daha pisdir. Ən çox istifadə olunan sütun 5 μm hissəcik ölçüsü sütunudur; ayırma tələbi yüksək olarsa, 1,5-3 μm-lik doldurucu seçilə bilər ki, bu da bəzi mürəkkəb matrisli və çoxkomponentli nümunələrin ayrılması probleminin həlli üçün əlverişlidir. UPLC 1,5 μm dolduruculardan istifadə edə bilər; 10 μm və ya daha böyük hissəcik ölçüsü doldurucular tez-tez yarı hazırlıq və ya hazırlayıcı sütunlar üçün istifadə olunur. 2.4 Karbon tərkibi
Karbon tərkibi xüsusi səth sahəsi və bağlanmış faza örtüyü ilə əlaqəli olan silikagelin səthində bağlanmış faza nisbətinə aiddir. Yüksək karbon tərkibi yüksək sütun tutumu və yüksək ayırdetmə təmin edir və tez-tez yüksək ayırma tələb edən mürəkkəb nümunələr üçün istifadə olunur, lakin iki faza arasında uzun qarşılıqlı əlaqə müddəti səbəbindən təhlil müddəti uzundur; aşağı karbon tərkibli xromatoqrafik sütunlar daha qısa analiz müddətinə malikdir və müxtəlif seçicilik göstərə bilər və tez-tez sürətli analiz tələb edən sadə nümunələr və yüksək sulu faza şəraiti tələb edən nümunələr üçün istifadə olunur. Ümumiyyətlə, C18-in karbon tərkibi 7%-dən 19%-ə qədərdir. 2.5 Məsamə ölçüsü və xüsusi səth sahəsi
HPLC adsorbsiya mühiti məsaməli hissəciklərdir və əksər qarşılıqlı təsirlər məsamələrdə baş verir. Buna görə də molekullar adsorbsiya olunmaq və ayrılacaq məsamələrə daxil olmalıdırlar.
Məsamə ölçüsü və xüsusi səth sahəsi bir-birini tamamlayan iki anlayışdır. Kiçik məsamə ölçüsü böyük xüsusi səth sahəsi deməkdir və əksinə. Böyük bir spesifik səth sahəsi nümunə molekulları və birləşdirilmiş fazalar arasında qarşılıqlı əlaqəni artıra, saxlama qabiliyyətini artıra, nümunə yüklənməsini və sütun tutumunu və mürəkkəb komponentlərin ayrılmasını artıra bilər. Tam məsaməli doldurucular bu tip dolduruculara aiddir. Yüksək ayırma tələbləri olanlar üçün böyük xüsusi səth sahəsi olan doldurucuları seçmək tövsiyə olunur; kiçik xüsusi səth sahəsi arxa təzyiqi azalda, sütunun səmərəliliyini yaxşılaşdıra və gradient analizi üçün uyğun olan tarazlıq vaxtını azalda bilər. Bu tip dolduruculara nüvə qabığı doldurucular aiddir. Ayrılmanın təmin edilməsi üçün yüksək analiz səmərəliliyi tələbləri olanlar üçün kiçik xüsusi səth sahəsi olan doldurucuların seçilməsi tövsiyə olunur. 2.6 Məsamə həcmi və mexaniki möhkəmlik
Məsamə həcmi, həmçinin "məsamə həcmi" olaraq da bilinir, vahid hissəcik üçün boşluq həcminin ölçüsünə aiddir. Doldurucunun mexaniki gücünü yaxşı əks etdirə bilər. Böyük məsamə həcmi olan doldurucuların mexaniki gücü kiçik məsamə həcmi olan dolduruculardan bir qədər zəifdir. Məsamə həcmi 1,5 mL/q-dan az və ya ona bərabər olan doldurucular əsasən HPLC-nin ayrılması üçün, məsamə həcmi 1,5 mL/q-dan çox olan doldurucular isə əsasən molekulyar xaricetmə xromatoqrafiyası və aşağı təzyiqli xromatoqrafiya üçün istifadə olunur. 2.7 Məhdudlaşdırma dərəcəsi
Qapaqlama birləşmələr və məruz qalmış silanol qrupları arasında qarşılıqlı təsir nəticəsində yaranan qalıq zirvələrini azalda bilər (məsələn, qələvi birləşmələr və silanol qrupları arasında ion əlaqəsi, van der Waals qüvvələri və turşu birləşmələr və silanol qrupları arasında hidrogen bağları), bununla da sütunun səmərəliliyini və pik formasını yaxşılaşdırır. . Qapaqsız bağlanmış fazalar, xüsusən də qütb nümunələri üçün qapaqlı bağlanmış fazalara nisbətən fərqli seçicilik yaradacaq.
- Müxtəlif maye xromatoqrafiya sütunlarının tətbiq dairəsi
Bu fəsil bəzi hallarda müxtəlif növ maye xromatoqrafiya sütunlarının tətbiq dairəsini təsvir edəcəkdir.
3.1 Əks fazalı C18 xromatoqrafik sütun
C18 sütunu ən çox istifadə edilən tərs fazalı sütundur, əksər üzvi maddələrin məzmunu və çirklilik testlərinə cavab verə bilər və orta qütblü, zəif qütblü və qeyri-qütblü maddələrə tətbiq olunur. C18 xromatoqrafik sütunun növü və spesifikasiyası xüsusi ayırma tələblərinə uyğun seçilməlidir. Məsələn, yüksək ayırma tələbləri olan maddələr üçün 5 μm * 4.6 mm * 250 mm spesifikasiyalar tez-tez istifadə olunur; mürəkkəb ayırma matrisləri və oxşar polariteli maddələr üçün 4 μm*4,6 mm*250 mm spesifikasiyalardan və ya daha kiçik hissəcik ölçülərindən istifadə edilə bilər. Məsələn, müəllif selekoksib API-də iki genotoksik çirki aşkar etmək üçün 3 μm*4,6 mm*250 mm sütundan istifadə etmişdir. İki maddənin ayrılması 2,9-a çata bilər, bu əladır. Bundan əlavə, ayrılmanın təmin edilməsi şərti altında, sürətli təhlil tələb olunarsa, tez-tez 10 mm və ya 15 mm qısa bir sütun seçilir. Məsələn, müəllif piperakin fosfat API-də genotoksik çirki aşkar etmək üçün LC-MS/MS-dən istifadə etdikdə, 3 μm*2,1 mm*100 mm sütundan istifadə edilmişdir. Çirklənmə ilə əsas komponent arasındakı ayırma 2.0 idi və nümunənin aşkarlanması 5 dəqiqə ərzində tamamlana bilər. 3.2 Ters fazalı fenil sütunu
Fenil sütunu da tərs fazalı sütun növüdür. Bu tip sütun aromatik birləşmələr üçün güclü seçiciliyə malikdir. Adi C18 sütunu ilə ölçülən aromatik birləşmələrin reaksiyası zəifdirsə, fenil sütununu əvəz etməyi düşünə bilərsiniz. Məsələn, mən celecoxib API hazırlayarkən eyni istehsalçının fenil sütunu və eyni spesifikasiya ilə ölçülən əsas komponent reaksiyası (hamısı 5 μm*4,6 mm*250 mm) C18 sütunundan təxminən 7 dəfə çox idi. 3.3 Normal fazalı sütun
Ters fazalı sütuna effektiv əlavə olaraq, normal fazalı sütun yüksək qütblü birləşmələr üçün uyğundur. Əgər tərs fazalı sütunda 90%-dən çox sulu faza ilə süzülmə zamanı pik hələ də çox sürətlidirsə və hətta həlledici pik nöqtəsinə yaxındırsa və onunla üst-üstə düşürsə, siz normal fazalı sütunu əvəz etməyi düşünə bilərsiniz. Bu tip sütuna hilik sütun, amin sütunu, siyano sütunu və s.
3.3.1 Hilik sütunu Hilik sütunu qütb maddələrinə reaksiyanı artırmaq üçün adətən hidrofilik qrupları birləşdirilmiş alkil zəncirinə daxil edir. Bu tip sütun şəkər maddələrinin təhlili üçün uyğundur. Müəllif ksiloza və onun törəmələrinin tərkibini və əlaqəli maddələrini tərtib edərkən bu tip sütundan istifadə etmişdir. Ksiloza törəməsinin izomerləri də yaxşı ayrıla bilər;
3.3.2 Amin sütunu və siano sütunu Amin sütunu və siano sütunu xüsusi maddələr üçün seçiciliyi yaxşılaşdırmaq üçün müvafiq olaraq birləşdirilmiş alkil zəncirinin sonunda amin və siyano modifikasiyalarının tətbiqinə istinad edir: məsələn, amin sütunu yaxşı seçimdir şəkərlərin, amin turşularının, əsasların və amidlərin ayrılması üçün; siyano sütunu birləşmiş bağların olması səbəbindən hidrogenləşdirilmiş və hidrogenləşməmiş struktur oxşar maddələri ayırarkən daha yaxşı seçiciliyə malikdir. Amin sütunu və siyano sütunu tez-tez normal faza sütunu və əks faza sütunu arasında dəyişdirilə bilər, lakin tez-tez keçid tövsiyə edilmir. 3.4 Xiral sütun
Xiral sütun, adından da göründüyü kimi, xüsusilə əczaçılıq sahəsində şiral birləşmələrin ayrılması və təhlili üçün əlverişlidir. Adi tərs faza və normal faza sütunları izomerlərin ayrılmasına nail olmadıqda bu tip sütun hesab edilə bilər. Məsələn, müəllif 1,2-difeniletilendiaminin iki izomerini ayırmaq üçün 5 μm*4,6 mm*250 mm xiral sütundan istifadə etmişdir: (1S, 2S)-1, 2-difeniletillendiamin və (1R, 2R)-1, 2 -difeniletillendiamin və ikisi arasındakı ayrılma təxminən 2.0-a çatdı. Bununla belə, şiral sütunlar digər növ sütunlardan daha bahalıdır, adətən 1W+/piece. Belə sütunlara ehtiyac varsa, vahid kifayət qədər büdcə tərtib etməlidir. 3.5 İon mübadiləsi sütunu
İon mübadiləsi sütunları ionlar, zülallar, nuklein turşuları və bəzi şəkər maddələri kimi yüklü ionların ayrılması və təhlili üçün uyğundur. Doldurucu növünə görə onlar kation mübadilə sütunlarına, anion mübadilə sütunlarına və güclü kation mübadiləsi sütunlarına bölünür.
Kation mübadiləsi sütunlarına kalsium əsaslı və hidrogen əsaslı sütunlar daxildir ki, bunlar əsasən amin turşuları kimi katyonik maddələrin təhlili üçün əlverişlidir. Məsələn, müəllif kalsium qlükonatı və kalsium asetatı yuyulma məhlulunda təhlil edərkən kalsium əsaslı sütunlardan istifadə etmişdir. Hər iki maddə λ=210nm-də güclü reaksiyalara malik idi və ayrılma dərəcəsi 3,0-a çatdı; müəllif qlükoza ilə əlaqəli maddələri təhlil edərkən hidrogen əsaslı sütunlardan istifadə etmişdir. Bir neçə əsas əlaqəli maddələr - maltoza, maltotrioza və fruktoza - diferensial detektorlar altında yüksək həssaslığa malik idi, aşkarlama həddi 0,5 ppm qədər və ayrılma dərəcəsi 2,0-2,5 idi.
Anion mübadiləsi sütunları əsasən üzvi turşular və halogen ionları kimi anion maddələrin təhlili üçün uyğundur; güclü kation mübadiləsi sütunları daha yüksək ion mübadiləsi qabiliyyətinə və seçiciliyə malikdir və mürəkkəb nümunələrin ayrılması və təhlili üçün əlverişlidir.
Yuxarıdakılar müəllifin öz təcrübəsi ilə birlikdə bir neçə ümumi maye xromatoqrafiya sütunlarının növləri və tətbiqi diapazonlarına girişdir. Böyük məsaməli xromatoqrafik sütunlar, kiçik məsaməli xromatoqrafik sütunlar, yaxınlıq xromatoqrafiya sütunları, multimod xromatoqrafiya sütunları, ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafiya sütunları (UHPLC), superkritik maye xromatoqrafiya sütunları kimi faktiki tətbiqlərdə xromatoqrafik sütunların digər xüsusi növləri də mövcuddur. SFC) və s. Onlar müxtəlif sahələrdə mühüm rol oynayırlar. Xromatoqrafik sütunun xüsusi növü nümunənin strukturuna və xüsusiyyətlərinə, ayırma tələblərinə və digər məqsədlərə uyğun seçilməlidir.
Göndərmə vaxtı: 14 iyun 2024-cü il